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核酸雜交

發布時間:2007-8-30 訪問人數: 3271

核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開,而在條件恢復后又可依堿基配對規律形成雙邊結構。雜交通常在一支持膜上進行,因此又稱為核酸印跡雜交。根據檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交(Southern blot hybridization )和RNA印跡雜交(Northern blot hybridization)。其基本過程包括下列幾個步驟。

 。1)制備樣品:首先需要從待檢測組織樣品提取DNARNA。DNA應先用限制性內切酶消化以產生特定長度的片段,然后通過凝膠電泳將消化產物按分子大小進行分離。一般來說DNA分子有其獨特的限制性內切酶圖譜,所以經酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區帶。再將含有DNA片段的凝膠進行變性處理后,直接轉印到支持膜上并使其牢固結合。這樣等檢測片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離,然后轉印并交聯固定。

 。2)制備探針:探針是指一段能和待檢測核酸分子依堿基配對原則而結合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實驗中,探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。這樣,通過檢疫與恩印膜上的核酸分子結合上的探針分子,既可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置,也就是在電泳凝膠上的位置,也就知道了它的分子大小。

 。3)雜交:首先要進行預雜交,即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結合位點。由于轉印在膜上的核酸分子已經是變性的分子,所以雜交過程中只需變性標記好的探針,再讓探針與膜在特定的溫度下反應,然后洗去未結合的探針分子即可。

 。4)檢測:檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置;而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。

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